Methoden
Kraftmikroskopie und Kraftspektroskopie
Das AFM ((Atomic)- Force Microscope, deutsch: Rasterkraftmikroskop) wurde 1986 von Binning, Quate und Gerber entwickelt und dient der Abbildung von Oberflächen mit Nanometer-Auflösung, indem ein Spitze die Topographie vermisst. Gleichzeitig kann das AFM die zwischen der Spitze und der Oberfläche wirkende Kraft messen und so inter- und intramolekularen Wechselwirkungen charakterisieren. Abhängig von der Spitzengeometrie können einzelne Moleküle oder sogar einzelne Atome abgebildet werden.
Die Spitze befindet sich am Ende eines sogenannten Cantilevers, der typischerweise aus Silizium oder Siliziumnitrid besteht. Die Oberfläche und die Spitze werden durch Piezokeramiken zueinander in Angstrom-Schritten bewegt. Wenn die Spitze über die Oberfläche rastert, verbiegt sich der Cantilever abhängig von der Oberflächentopgraphie und dies ist andererseits eine Messung der zwischen der Spitze und der Oberfläche wirkenden Kraft.
Um die Verbiegung des Cantilevers zu detektieren, wird ein Laser auf die Rückseite fokussiert und durch diese über einen Spiegel auf eine 4-Quadrantendiode reflektiert. Die Bewegung des Cantilevers führt zu einer Veränderung des Reflexes und resultiert in einer Änderung des Photodiodensignals.
Mit einem AFM können zum Beispiel einzelne Moleküle, DNA und Proteine abgebildet werden. Mit der sogenannten Hochauflösenden Kraftmikroskopie können die Untereinheiten von einzelnen Membranproteinen in Nanometer-Auflösung und auch deren Konformationsänderungen, der oligomere Zustand, die Molekulardynamik und die Assemblierung beobachtet werden.
Ein anderer Modus ist die sogenannte Kraftspektroskopie, bei der einzelne Moleküle zwischen der Spitze und deren Oberfläche angebunden werden, und eine Kraft durch die Bewegung des Cantilevers in vertikale Richtung auf diese ausgeübt wird. Diese Kraft und die daraus resultierende Streckung des Moleküls werden mit Kraft-Distanz-Kurven veranschaulicht und zeigen die mechanische Stabilität des Moleküls oder des Molekülkomplexes, sowie die Entfaltungswege und Entfaltungszwischenschritte von einzelnen Proteinen.
Eine mögliche Anwendung ist die Erkennung von molekularen Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen und die Erforschung von Strukturänderungen bedingt durch äußere Einflüße. Einer der entscheidenden Vorteile des AFMs ist die Möglichkeit Biomoleküle in ihrer physiologischen Umgebung, zum Beispiel in Flüssigkeiten, untersuchen zu können. Gleichzeitig kann das AFM zur Untersuchung von mechanischen Eigenschaften und zur Messung von Reibung und Viskosität verwendet werden. Die Messung der Konformation und der mechanischen Antwort auf angewandte Kräfte ermöglicht die Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen.
Einzelmolekülfluoreszenz und FRET
Mit Hilfe der wellenlängen- und polarisationsdispersiven Einzelmolekülfluoreszenzspektroskopie in Kombination mit der zeitkorrelierten Einzelphotonenzählung (engl. time-correlated single photon counting, TCSPC) ist es möglich Aussagen zu Protein-Protein-Interaktionen und Aggregationsprozessen, sowie Aussagen zu Konformationsänderungen und deren Fluktuationen auf entsprecheneden Zeitskalen machen zu können. Dies ist möglich, da bei Einzelmolekülmessungen im Vergleich zu ensemble-Messungen nicht über viele Moleküle gemittelt wird, sondern bestimmte Eigenschaften eines einzelnen Moleküls über die Zeit verfolgt werden können.
TCSPC Messungen liefern ein Maximum an Information (wie Fluoreszenzraten, quenching, Triplettanteil, etc.) über einzelne Fluorophore, die an das zu untersuchende Molekül gebunden sind und als eine Art Sensor für das Molekül und seine Umgebung fungieren.
Zwei oder mehr Fluorophore können als Donor und Akzeptor für Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Trasnsfer-Messungen (FRET) Anwendung finden und somit für Distanzmessungen auf molekularer Ebene eingesetzt werden. FRET erlaubt außerdem Konformationsänderungen von Molekülen zu verfolgen und beispielsweise bei Proteinen zwischenmolekulare Zustände der Proteinfaltung zu erkennen. Anhand der Daten von FRET-Messungen können Modelle und Mechanismen evaluiert werden und beispielsweise als 'input' für Moleküldynamiksimulationen dienen.
Oberflächenchemie
Die Oberflächenchemie und Oberflächenentwicklung beinhalten die Modifikationen von Oberflächeneigenschaften und deren weitere Erforschung, sowie die Untersuchung von Reaktionen am Interface.
Das AFM kann dafür verwendet werden, unterschiedlichste Oberflächen und ihre
Modifikationen zu untersuchen. Außerdem können einzelne Moleküle adsorbiert oder an ein festes Substrat gebunden werden. Besonders glatte Oberflächen, wie Mica oder Quarz, sind besonder gut für Messungen mit AFM geeignet. Abhängig von den zu untersuchenden Molekülen oder Proben, muss eine Funktionalisierung der Oberfläche erfolgen.
In unserer Gruppe untersuchen wir den Aufbau von künstlichen Lipidmembranen und arbeiten an der Funktionalisierung von Quarz, was uns die Bindung einer Doppellipidmembran an die Oberfläche ermöglicht (tBLM=tethered bilayer lipid membrane). Unser Ziel ist es, eine Membran herzustellen, die einer biologischen Membran in ihrer Funktionalität und Stabilität ähnlich ist. Dieses System erlaubt es, Membran-proteine in die Membran zu integrieren, um dann Kraftmessungen durchzuführen. Die Funktionalisierung ist auch auf anderen Oberflächen, wie z. B. Mica, möglich.