Phagendisplay
Phagendisplay ist eine effektive und zuverlässige Methode, um Peptidliganden eines immobilisierten Zielmoleküls zu selektieren. Man macht sich hierbei zu Nutze, dass Bakteriophagen gewisse Veränderungen innerhalb der Strukturgene tolerieren. Bei der Erstellung einer Phagen-insertierten Peptidbibliothek wird daher eine randomisierte Nukleotidsequenz in das Genom von M13-Phagen eingebracht, so dass die resultierenden Phagen ein verändertes Oberflächenprotein (hier GP3) produzieren, welches ein Peptid der Peptidbibliothek enthalt. Der Genotyp ist so mit dem Phänotyp verknüpft. Der Vorteil der Anwendung von Phagendisplay ist, daß in kurzer Zeit große Peptidbibliotheken nach Peptiden durchsucht werden können, die eine bestimmte Bindung mit dem Zielprotein eingehen. Dabei kann eine größere Bandbreite an unterschiedlichen Peptiden untersucht werden, da die Verwendung rein synthetischer Peptide eine Randomisierung jeder einzelnen Aminosäureposition zulässt.
Bei der Durchführung der Phagendisplay-Selektion wird das Targetprotein auf einer Plastikoberflache immobilisiert und freie Bindungsstellen anschließend blockiert. Nach der Inkubation mit der Phagenbibliothek werden nicht-bindende Phagen in mehreren Waschschritten entfernt. Am Ende jeder Selektionsrunde werden die noch gebundenen Phagen eluiert, amplifiziert und (immer in gleicher Anzahl) in die nächste Selektionsrunde eingesetzt. Nach mehreren Selektionsrunden wird der Erfolg der Selektion mittels Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) überprüft und gegebenenfalls die DNS der selektierten Phagen sequenziert.
Die Bindungsaffinität der synthetisch hergestellten Peptide zu dem entsprechenden Targetprotein kann anschließend mittels verschiedener biophysikalischer Methoden (Oberflächenplasmonresonanz Spektroskopie, Fluoreszenzspektroskopie, Switch-Sense Technologie und NMR–Spektroskopie) quantifiziert und charakterisiert werden. In Aggregationsanalysen (z.B. mittels Qiad Assay) und Zytotoxiziätstests wird ihr therapeutisches Potential eingehender untersucht.
Literatur:
Pavlidou M., 2013, Identifizierung von artifiziellen Liganden eines in Nanodiscs inkorporierten integralen Membranproteins, Schriften des Forschungszentrums Jülich, ISSN 1866-1807